药物成瘾研究的心理生理学技术初探*

刘伟, 汪伟伟, 黄军  指导教师：汪萌芽

(皖南医学院细胞电生理研究室, 芜湖 241002)

摘要：依据药物成瘾可能是脑内奖赏系统和惩罚系统间平衡紊乱的假设，为了将药物成瘾的精神依赖和躯体依赖进行综合性研究，我们首先建立脑内奖赏系统关键核团腹侧背盖区（VTA）和惩罚系统重要核团基底外侧杏仁核（BLA）电活动的同步记录技术，然后与心电、呼吸肌肌电、皮肤电导、体温等多项生理指标同步记录技术相结合，进一步建立成年大鼠脑内双核团细胞外记录与多项生理指标联合记录的心理生理学实验技术，并对记录到的6项指标进行了初步分析。研究结果为药物成瘾脑机制的综合性研究提供了一种新的心理生理学实验技术。

关键词：药物成瘾，细胞外记录，心理生理学，多导生理记录

药物成瘾包括精神依赖和躯体依赖。躯体依赖可以随着各种戒毒方法的应用渐渐消退，但精神依赖却可长久存在，导致成瘾者再次使用成瘾药物（复吸）【】。目前关于药物成瘾的研究既有心理角度的摸索，也有生理方面的探究，但多为分别进行，鲜见用心理生理学综合技术来研究的报道。根据中枢神经系统存在奖赏和惩罚双重系统，我们提出了“药物成瘾可能是奖赏系统和惩罚系统间平衡紊乱”这一假设。为了从精神依赖和躯体依赖，即心理和生理两方面同时进行实验研究，我们建立了以脑内奖赏和惩罚系统密切相关的特定核团同步记录，联合多项生理指标记录的技术，初步报道如下。

1材料和方法

1.1  实验动物 选用280g~300g SD 成年大鼠10只，雌雄不拘，由南京青龙山动物繁殖场提供。

1.2  仪器设备及药品 常规动物手术器械，双层铜网电生理屏蔽罩和防震台，手术显微镜、脑立体定位仪、牙科钻和保温毯。不锈钢同芯金属电极、金属参考电极和微电极放大器，PowerLab 八通道生理信号采集与处理系统（澳大利亚埃德仪器有限公司生产）及其Chart Pro记录和分析软件。振荡切片机（Vibratome）。20%乌拉坦等。

1.3  实验方法

1.3.1 多项生理指标同步记录 取大鼠用20% 乌拉坦按1.5g/kg剂量腹腔注射麻醉，麻醉平稳后，用四肢捆绑法将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪，下垫保温毯维持体温，放置在双层铜网电生理屏蔽罩内的防震台上。将体温换能器探头置于大鼠肛门内，进行体温信号的采集。在大鼠右前肢用针式电极插入腕关节上部的前臂皮下，左后肢用针式电极插入踝关节上部的大腿皮下，右后肢接地，记录标准肢体Ⅱ导联心电图。将2根针式电极插入大鼠右侧腋中线第9肋下缘肋间外肌内，记录呼吸肌肌电图。将2块板式皮肤电导电极，用医用胶布分别固定于大鼠左前掌背面和腹面，记录皮肤电导。

1.3.2 脑深部双核团细胞外记录 头部备皮。调节耳杆使左右对称，固定大鼠头部使之不能移动。用手术刀切开头皮，3%H2O2擦拭充分止血，暴露颅骨标志（前囟、人字缝）。调节前囟、人字缝到同一水平平面。定位腹侧背盖区（VTA）：前囟后（AP），-6.72~-6.84mm；旁开（L/R），0.4~1.13mm；硬膜表面以下（DV）7.5~8.5mm；基底外侧杏仁核（BLA）：AP，-1.56~-3.36mm；L/R，3.9~4.6mm；DV，7.8~8.82mm【】。以牙科钻钻颅开窗，手术显微镜下用显微剪剪开硬脑膜、蛛网膜和软脑膜，3%H2O2充分止血。使用同芯金属电极在操作臂的牵引下移至颅窗上，并紧贴脑组织，2%盐水琼脂封窗。安置好参考电极、接地电极。记录电极接入记录放大、记录系统。操纵电极下至目标脑区后，寻找合适、明确的细胞外电活动信号，待稳定后连续观察20min。记录电极所引导和记录的信号经放大器，进入PowerLab多导生理信号采集与处理系统，由计算机中Chart软件进行采集、存盘。

实验结束, 取脑于4%甲醛溶液内固定后 冰冻冠状面切片, 观察针道位置与图谱VTA、BLA的位置进行比对，进行记录位点鉴定。

1.4 数据分析 记录到的脑内核团电活动信号，分别使用Chart Pro系统软件进行数据测量和分析，包括独立指标的时域和频域分析，相关指标的相关性观察和分析等。结果以 表示。用Origin5.0软件（Microcal Software Inc., USA）进行相关数据的统计分析和作图。P<0.05为差异有显著性意义。

2 实验结果

2.1 多通道同步记录 在对脑内VTA、BLA核团电活动进行同步细胞外记录的同时，监测体温、心电、肋间外肌肌电、皮肤电导等生理指标，一个典型的6通道同步记录例示于图1。

图 1  A 为6项心理生理指标同步记录原始图形； B 为A 图中四项生理指标（虚线框）的放大

2.2 

2.3  VTA、BLA核团电活动特性及其相关性分析 直方图分析是细胞外记录的主要方法，其反映核团或神经元电活动的频率，对评估细胞外电活动有重要意义。VTA、BLA电活动的直方图见图2。

图 2.  VTA、BLA同步放电直方图.  A. 峰峰间期直方图；B. 频率直方图；C 幅度直方图

上图中峰峰间期直方图表示在所记录的区域和时间内细胞外放电主要集中于峰峰间期较小的部分，也就是频率较高的活动。频率直方图反映在所记录的区域和时间内随时间变化放电频率改变。幅度直方图说明在所记录区域和时间内电活动以小幅为主。从以上同步记录的直方图来看，VTA和BLA的电活动大体趋势类似。

进一步对VTA和BLA电活动的频率进行相关性分析，即在选定时段内，将同一时间（100s）的VTA电活动频率与BLA电活动频率进行相关分析，一只大鼠的分析结果见图3，表明VTA与BLA的电活动存在一定程度的正相关（r=0.5370, P=0.058），且VTA的电活动频率低于BLA（配对t检验，P<0.01）。

图3. VTA电活动频率与BLA电活动频率的相关分析

    对10只SD大鼠VTA、BLA的同步记录电活动，用Chart Pro软件测出18 min的平均频率，再进行相关性分析，结果见图4，亦可看出BLA电活动频率有高于VTA的趋势（配对t检验，P=0.059），且有一定的正相关趋势（r=0.5316, P<0.092）。

图 4.  VTA-BLA电活动频率的相关性分析

2.3 生理指标特性及其相关性 本实验同步记录大鼠体温、皮肤电导、心电图和呼吸肌肌电图4项生理指标。应用Chart Pro软件可以对大鼠心电图、肌电图等生理指标进行全面的时域和频域分析。现将1只大鼠的体温、皮肤电导、心电信号各段以及肌电图周期活动进行的初步分析结果例示于表1、表2和表3。

表 1. 大鼠体温、皮肤电导检测结果

表 2.  大鼠心电信号检测结果

表 3. 呼吸肌肌电信号检测结果

2.4 VTA、BLA电活动与生理指标间的相关性  应用本技术不仅可以分别对脑内核团间的电活动进行相关性分析，以及生理指标间的相关性分析，同时还可以进行脑内核团电活动与生理指标间的相关性分析。图5例示了脑内VTA和BLA电活动与生理指标的相关性记录结果，图中在时间轴为15:15处（图中箭头所指处），先出现VTA和BLA电活动的明显减弱，随后出现呼吸肌肌电图的明显增强，并伴有明显的皮肤电导波动波。

图 5. 脑内VTA和BLA电活动与生理指标的相关性. A. 原始记录，B 为A 图中四项生理指标（虚线框）的放大

3 讨论

药物成瘾是困扰人类的重大问题，长久以来人们对于成瘾机制尽管有了较为深入的探索，但尚未完全阐明。目前认为，药物成瘾主要与大脑边缘叶多巴胺系统有关，其中最重要的是VTA-伏隔核(NAc)通路，即认为从情绪角度称之为奖赏系统的脑内结构被认为是多种物质成瘾的相同基础【】。就阿片类成瘾性物质而言，其作用位点主要在VTA【】，吗啡增加VTA的电活动且戒断状态下表现相反【、】。当受到负性刺激时，VTA中多巴胺能神经元被抑制【】，但若能躲避负性刺激，也是一种奖赏【】。一旦成瘾而不能及时得到足够的成瘾物质时，便会出现一系列躯体精神症状，称之为戒断症状。随着时间的延长，躯体症状可以渐渐消退，但精神依赖却难以磨灭，并会导致复吸。Koob从情绪机制的角度提出成瘾是由于前期的正性强化（即奖赏），后期停药又受到负性强化（即戒断），二者共同作用导致成瘾【4】，而BLA参与了负性强化过程【】。参与负性强化的中枢称为惩罚系统，杏仁核正是惩罚效应的中枢【】。有文献表明，VTA与BLA之间存在与恐惧、焦虑相关的通路，并且VTA抑制恐惧焦虑的发生，而BLA则对该类情绪表现出促进作用【】。基于以上理由，本实验技术分别选择VTA与BLA作为奖赏和惩罚系统的代表脑区。

我们认为奖赏系统与惩罚系统同为情绪系统的一部分，应当时刻共同起作用，而不应将其人为地分出作用阶段。并且奖赏与惩罚相互作用有着足够的证据，所以我们提出“在生理状态下奖赏系统与惩罚系统应存在一种平衡关系，而成瘾正是这种平衡紊乱的结果“这一假设。

从奖赏和惩罚的角度来研究药物成瘾，就是探究成瘾的情绪机制。而对动物模型的情绪研究，目前多采用行为学的研究方法，其缺点是客观性不够，结果易受多种因素干扰。但在对人的研究中有一种利用多导生理记录仪记录的皮肤电导、心率、脉搏、心电、呼吸、面部肌电和脑电等信号来进行情绪评估的方法【】。为此，我们尝试在大鼠模型上，建立双核团细胞外记录和多导生理指标同步记录技术，同时分析奖赏系统与惩罚系统代表核团深部脑电活动，以及多项生理指标的活动。

细胞外单元记录是研究中枢神经系统单个核团的电活动特性和神经元在不同行为状态下放电形式的主要手段【13】。其是将引导电极放置在神经细胞或神经组织的表面或邻近部位，引导与记录有关放电活动【】。当神经细胞或神经组织发生兴奋性活动时，其膜电流会影响记录电极与参考电极之间的电位差，所得信号可经记录、放大、分析系统处理，从而反映出核团或神经元活动的状态。细胞外记录不损伤或插入细胞内，可做麻醉或清醒状态下的在体记录，故能反映出神经元在整体神经系统背景下的活动情况，是细胞电生理的重要技术手段之一。我们所采用的双核团细胞外电信号同步记录技术可分析药物成瘾后奖赏和惩罚系统核团电活动的变化，是探究两系统在药物成瘾精神依赖中作用的先进技术手段。

本实验所测的肌电、心电、皮肤电导和体温等是重要的生理指标，且都是无创检测指标。药物成瘾大鼠戒断时可表现为以下体征【】：齿颤、咀嚼、直立、湿狗样抖、跳跃、上睑下垂、流泪、流涎、眨眼、腹泻等等，而这些体征都可反应在生理指标的变化上。多项生理指标同步记录有助于分析药物成瘾躯体依赖的机制，并可以联合脑内VTA与BLA核团电活动对动物情绪进行综合性分析和评估。

从实验结果来看，本实验方法可以很好的同步记录脑内VTA与BLA双核团电活动和多项生理活动信号。可以对这些信号进行系统的分析（如心电、肌电），也可以做与其他信号之间的相关性分析。我们在试验中摒弃传统有创的气管插管法和膈肌肌电活动评估呼吸功能的做法，改为记录肋间肌肌电活动。参考文献报道从腋前线第9肋骨下缘进针，不会穿透胸膜伤及肺【】。这样一方面可以在无创条件下记录呼吸情况，另一方面还可以分析诸如肋间肌活动度等其他相关指标。上文所述肋间肌肌电频率与同等条件下大鼠呼吸频率相符。

    本实验表明，该套方法的优势表现在一方面可以在活体动物上同时对两处深部核团进行细胞外电信号记录，可以在整体背景下进行药物成瘾奖惩相关核团功能联系的分析；另一方面可以实现多项生理指标同步记录，能较为全面地分析药物成瘾躯体依赖导致的生理指标变化，并评估动物情绪变化。该套实验技术是从心理学和生理学交叉技术的角度，联合分析心理生理指标，为药物成瘾机制的综合性研究提供了新的技术。

参考文献